Т клеточная защита что это
Что такое Т клеточный иммунитет?
Кроме гуморального иммунитета в защите от заражения играет роль и Т клеточный иммунитет. Ключевым игроком этого пути защиты являются цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+, Т киллеры), которые убивают уже зараженные вирусом клетки, распознавая на их поверхности «вражеские антигены». Т-хелперы (СD4+) также важны и стимулируют работу других иммунных клеток, высвобождая цитокины. Эпитопами для Т клеточного иммунитета могут выступать участки спайк-белка и других белков, включая N, M, nsp3, nsp4, ORF3a и ORF8. Однако роль Т клеточного иммунитета в защите от covid-2019 мало изучена.
У некоторых людей, никогда не болевших covid-2019, обнаруживается Т клеточный иммунитет к SARS-CoV-2. Это перекрестный иммунитет к сезонным коронавирусам, с которыми человек встречался в прошлом. Такая кросс-реактивность возможна, поскольку Т клеточный иммунитет длительный, и эпитопы Т клеток «короткие».
В редких случаях после болезни или вакцинации у человека может не быть антител, но все равно может быть сформирован Т клеточный иммунитет.
Для формирования Т клеточного иммунитета антиген должен быть сначала фрагментирован и презентирован (показан) Т лимфоцитам другой клеткой (антигенпрезентирующей клеткой). В роли такой клетки может выступить:
любая зараженная клетка организма, в которой синтезировался антиген, в этом случае происходит презентация эндогенного антигена в комплексе с МНСI Т киллерам (СD8+),
специальная клетка иммунной системы, которая поглотит антиген (дендритные клетки, макрофаги) или В-лимфоцит. В этом случае происходит презентация экзогенного антигена в комплексе с МНСII Т хелперам (СD4+).
мРНК и аденовирусные вакцины (Pfizer, Спутник…) доставляют генетическую информацию для синтеза антигена непосредственно в клетку, это позволяет безопасно «имитировать» естественное заражение, стимулировать синтез белка внутри клетки и его презентацию Т киллерам. В результате формируется сбалансированный и эффективный CD8+ и CD4+ Т клеточный иммунитет, как при натуральной инфекции.
Инактивированные цельновирионные (Ковивак), белковые и пептидные (ЭпиВакКорона) вакцины не доставляют антигены внутрь клеток. Предполагается, что инактивированные вакцины формируют более слабый Т клеточный иммунитет, который возможет только за счет поглощения антигенов и их презентации специальными иммунными клетками Т хелперам, Т цитотоксический ответ киллеров под вопросом. Формирование Т клеточного иммунитета для инактивированных вакцин от covid-2019 пока не описано и не изучено.
Часто после Ковивака обнаруживается небольшой Т клеточный иммунитет по Тигра тесту с интерфероном. Скорее всего, это кросс-презентация антигена дендритными клетками в комплексе с MHCI CD8+ Т-киллерам (содержат немного MHCI).
Описан новый тип иммунитета к коронавирусу: Т-клеточная загадка
Он может быть у половины людей, которые не болели COVID-19
До определенного момента априори считалось, что, поскольку SARS-CoV-2 — вирус новый, ни у кого к нему нет иммунитета. Однако уже несколько научных работ доказали то, что так называемый врожденный иммунитет к коронавирусу, основанный на памяти клеток, — не фантастика. При этом сегодня ученые полагают, что врожденный иммунитет к «короне» может иметь даже большее число людей, чем считалось ранее.
Недавно ученые проанализировали шесть научных исследований, которые доказали, что так называемый специфический Т-клеточный иммунитет к COVID-19 есть у 20–50% людей, которые ранее с ним не встречались. Результаты работы опубликованы в научном журнале BMJ.
Авторы двух из проанализированных исследований предполагают, что причина появления иммунитета к новой «короне» — перекрестный иммунитет, который сформировался после контакта с другими типами коронавирусов. В результате контакт с зараженным SARS-CoV-2 у таких людей не обязательно ведет к инфицированию, инфицирование не обязательно ведет к болезни, а болезнь не обязательно вызывает антитела, которые можно обнаружить. Ученые отмечают, что даже в тех регионах, где во время пандемии COVID-19 наблюдался самый большой рост смертности, серологические обследования после пика показали, что не более одной пятой части населения имеют антитела к SARS-CoV-2: таких 23% в Новой Зеландии, 18% в Нью-Йорке, 11% в Лондоне и 12% в Мадриде. Среди населения в целом цифры значительно ниже.
Поэтому сегодня на первый план выходит значение клеточного иммунитета, который формируется по итогам контактов с вирусами. В его основе — так называемые Т-лимфоциты, которые дают клеткам организма команду на выработку антител при новой встрече с вирусом. В итоге, даже если антител в крови переболевших не обнаруживается, это не значит, что у них нет иммунитета: при новом контакте с вирусом Т-лимфоциты запускают их «производство». В результате у людей либо вообще не проявляется симптомов заболевания, либо оно проходит в стертой форме. Сегодня вирусологи объясняют то, что 80% инфицированных переживают новую коронавирусную инфекцию легко, именно работой Т-клеточного иммунитета.
Одно из исследований, проведенных в США, проанализировало образцы донорской крови, полученные с 2015 по 2018 год, — в 50% из них обнаружились Т-клетки к SARS-CoV-2. Аналогичное исследование в Нидерландах выявило 20% образцов крови с Т-клетками. В Германии реактивные Т-клетки обнаружены у трети серонегативных по SARS-CoV-2 здоровых доноров (23 из 68). В Сингапуре группа исследователей проанализировала образцы крови, взятые у людей, не имевших контактов или личной истории с SARS или COVID-19; 12 из 26 образцов, взятых до июля 2019 года, показали Т-клетки к SARS-CoV-2, как и 7 из 11 образцов, взятых у людей, которые были серонегативны по отношению к вирусу. Аналогичные исследования с примерно такими же данными были проведены в Великобритании и Швеции. Да, во всех этих исследованиях изучались небольшие группы людей, но их результаты трудно игнорировать.
А сейчас вспомнили, что нечто похожее происходило во время пандемии свиного гриппа в 2009 году. Многие люди переносили его легко, что уже тогда объясняли наличием реактивных Т-клеток, образовавшихся в результате встречи с генетически сходными вирусами гриппа. Исследование, проведенное во время вспышки 2009 года Центром по контролю и профилактике заболеваний (CDC) США, показало, что 33% людей старше 60 лет имели перекрестно-реактивные антитела к вирусу H1N1.
Сегодня же ученые предполагают, что перекрестный иммунитет к SARS-CoV-2 может вырабатываться не только у тех, кто когда-то переболел сезонными человеческими коронавирусами, но даже и у тех, кто встречался с коронавирусами некоторых животных.
Теоретически вспышки инфекционных заболеваний следуют определенной траектории. Среди населения, лишенного иммунитета, быстро растет число новых инфекций. В какой-то момент в этом росте должен произойти перегиб, и заболеваемость начнет падать. В 1970-е годы прошлого века родилась теория, которая определила эту точку перегиба как порог коллективного иммунитета (HIT) и даже формулу для его определения HIT = 1−1/R0 (R0 — среднее количество вторичных случаев). По ней эксперты рассчитали, что при SARS-CoV-2 для достижения коллективного иммунитета необходимо, чтобы переболели по крайней мере 50% людей. Но есть и другие, более оптимистичные расчеты — таких должно быть от 10% до 20%. Ученые Оксфордского университета, например, полагают, что, когда в популяции есть люди с уже существующим иммунитетом, как могут показывать исследования Т-лимфоцитов, порог коллективного иммунитета может быть снижен до 10%.
Сегодня, например, все изучают феномен Швеции, где в начале эпидемии отказались от карантина — и количество заболевших и умерших зашкаливало. Сегодня же там в Стокгольме, городе с населением в 2 миллиона человек, всего 50 человек госпитализированы с COVID-19. Неужели в Швеции таки сформировался коллективный иммунитет? Шведский ученый Буггерт провел исследование: изучая близких родственников пациентов с подтвержденным COVID, он обнаружил Т-клеточные ответы у тех, кто был серонегативным или бессимптомным. В то время как около 60% членов семьи вырабатывали антитела, другие имели Т-клеточные ответы.
Однако сегодня, говоря об иммунитете, все сосредоточились на антителах. И разговоры о том, что антитела к SARS-CoV-2 начинают ослабевать всего через 2–3 месяца, подогревают слухи о повторных инфекциях. О них все чаще говорят даже врачи. «Внушает беспокойство все большее количество свидетельств от коллег о повторных заражениях и, что даже хуже, произошедших на фоне высоких титров антител», — отмечает московский кардиолог Алексей Федоров.
С Т-клетками все может быть иначе: сингапурские ученые, например, обнаружили реактивные Т-клетки к SARS-CoV-1 у пациентов, переболевших коронавирусом SARS, через 17 лет (!) после заражения. Столичный врач, пожелавший остаться анонимным, работавший в реанимации в 2003 году, рассказала обозревателю «МК», что и сама переболела SARS-CoV-1, которого, считалось, в России не было: «Переболели почти все мои коллеги — у нас были тяжелые пневмонии, очень похожие на те, что мы видим теперь. Однако в этот раз, заразившись SARS-CoV-2, я перенесла его почти без симптомов, на ногах, хотя отношусь к группе риска. И коллеги, болевшие тогда, сейчас, продолжая работать в реанимациях, либо не заражаются, либо болеют легко. Вирусы SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 генетически идентичны на 80%, и очевидно, что мы приобрели перекрестный иммунитет. По моим оценкам, в начале нулевых первым SARS переболели многие продавцы магазинов, летчики, сотрудники аэропортов».
«В начале пандемии ключевая мантра заключалась в том, что нам нужны данные об антителах, чтобы понять, кто был инфицирован и сколько из них было защищено, — написали иммунологи из Имперского колледжа Лондона. — Поскольку мы узнали больше об этой сложной инфекции, пришло время признать, что нам нужны и данные о Т-клетках».
Так что на фоне недавнего заявления представителя ВОЗ о том, что мы и близко не подошли к коллективному иммунитету, результаты исследований о клеточном иммунитете внушают некий оптимизм.
Раскрыта тайна Т-клеточного иммунитета к коронавирусу
Т-клетки «запомнили» старый коронавирус и быстро уничтожают новый
Любой мегаполис – это настоящий «вирусный котел», где примерно половина жителей уже имеет иммунитет к коронавирусу. И Москва – не исключение. Спасибо надо сказать болезням, перенесенным нами в предыдущие годы. Ведь среди них были другие коронавирусы, иммунитет к которым может защищать нас и от SARS-CoV-2.
Все дело в большом потенциале нашего Т-клеточного иммунитета, который изучают столичные ученые из Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н. И. Пирогова. Под его эгидой проходит широкомасштабное исследование Т-клеток, включая тестирование жителей столицы на предмет коллективной защиты от коронавиурса. Побеседовав с сотрудниками РНИМУ им.Пирогова, мы узнали, что:
– Иммунитет к SARS-CoV-2 может быть у людей, переболевших когда-то «кишечным гриппом» или обычными ОРВИ;
– Никто в мире, кроме российских ученых, пока не умеет определять Т-клеточный иммунитет по анализу ДНК клеток крови;
– Иммунитет у переболевших и вакцинированных от ковида людей может сохраняться десятки лет.
Т-клеточный иммунитет изучают сейчас во всем мире. Это, пожалуй, главная надежда человечества на освобождение от ковидного «плена».
Что такое «Т-клетки»?
Пожалуй, даже малые дети знают сегодня про антитела к коронавирусу. Если их нет — значит, вы еще не переболели, и у вас нет защиты от коварного вируса.
Исходя их общих правил иммунологии, если у человека есть (или были) антитела к коронавирусу, они не могли возникнуть без Т-лимфоцитов. Дело в том, что в самом начале болезни, примерно за неделю до появления первых симптомов, попавший в организм вирус «встречают» именно Т-клетки. Сообща, они «оценивают» его и, если «понимают», что проникших в организм чужеродных частиц много, и они не похожи на собственные белки организма, «решают», подлежат ли неизвестные интервенты уничтожению. Если решение принято, черную работу Т-клетки поручают В-клеткам (передают сигнал). В-клетки и начинают продуцировать антитела к новому вирусу. Сначала они синтезируют их внутри себя, а затем выставляют на поверхность В-клеточные рецепторы, которые, подобно антеннам, пеленгуют вирусные частицы, и, если находят их, то отрываются от материнской клетки и вступают в бой с врагом самостоятельно. Эти рецепторы и есть те самые антитела, или известные нам иммуноглобулины G (IgG). В идеале их должно быть много (высокий титр антител) и они должны быть максимально специфичными (способными эффективно связывать конкретный вирус). Такие антитела облепляют вирус со всех сторон, образуя некий конгломерат, который привлекает внимание всех участников иммунной системы, в частности, на подмогу приходят нейтрофилы и макрофаги.
Справившись с вирусом, антитела и сами постепенно исчезают (разбавляются). Сокращается и «руководство штаба» в виде Т-клеток, но не полностью.
“Нет людей без антител IgG к коронавирусу”
– Как бы вы не определяли, нет людей, у которых совсем не будет антител IgG.
– Даже к новому коронавирусу?
Как старые коронавирусы спасают москвичей
Теперь очень обнадеживающая информация от проректора по научной работе РНИМУ им. Пирогова Дениса Ребрикова, основанная как раз на факте присутствия в нашем организме отголосков «старых» коронавирусов. Проведенное в стенах университета крупномасштабное тестирование москвичей на Т-клеточный иммунитет показало, что около половины из нас обладают так называемым предсуществующим иммунитетом к SARS-CoV-2 (даже не переболев им)!
– Можно ли считать, что Т-клетками старых коронавирусов мы на сто процентов защищены от нового вируса?
– Сила предсуществующего Т-клеточного иммунитета у всех разная, и говорить о 100-процентной защите некорректно. Но можно утверждать, что значительное число москвичей до сих пор не заболело COVID-19 в том числе и по причине наличия хорошего Т-клеточного ответа на «старые» (обычные) коронавирусы.
– А если человек переболел «старым» коронавирусом, вакцинироваться от нового все равно надо?
– На всякий случай, конечно, лучше вакцинироваться. Тем более что тест на Т-клеточный иммунитет пока не стал рутинным и определить его быстро не получится. Всегда лучше иметь полный комплект противовирусного «вооружения», а вакцинация – очень мощный элемент защиты.
– На другие области и страны эта информация может распространяться?
– К сожалению, московские данные нельзя напрямую экстраполировать на всю Россию. Москва, как наверное, и другие крупные мегаполисы, уникальна своим разнообразием вирусов и плотностью населения, это настоящий бурлящий вирусный котел, где люди друг друга все время перезаражают с высокой скоростью из-за большой плотности населения. В небольших городах, в сельской местности – совсем другой эпидемиологический профиль, и там доля людей с предсуществующей защитой может быть значительно ниже. Зато в результате такого «вирусного котла» именно у жителей мегаполиса появился такой своеобразный бонус в виде Т-клеточного иммунитета к новому коронавирусу.
– Сколько человек прошло через ваше тестирование и каким способом вы выявляли Т-клетки к коронавирусу SARS-CoV-2 и старым коронавирусам?
– В Москве программу по оценке Т-клеточного иммунитета возглавляет профессор РАН, доктор биологических наук, директор НИИ трансляционной медицины РНИМУ им. Пирогова Дмитрий Чудаков. За последние полгода его лаборатории удалось проверить несколько тысяч пациентов методами высокопроизводительного секвенирования.
Его коллега из НМИЦ гематологии Минздрава России Григорий Ефимов параллельно сделал инструмент прямой оценки Т-клеточного иммунитета: так называемый МНС-тетрамер по выявлению ковид-специфичных Т-клеток. Под микроскопом он выглядит как шарик из искусственных иммуноглобулинов-МНС с кусочком вирусного белка. Внутри такого шарика присутствует либо флуоресцентная метка, либо крошечный наномагнит. Теперь представьте себе множество таких наноразмерных «шариков», собранных в единую суспензию. Если добавить такую суспензию к пробе, 1-2-м миллилитрам венозной крови, то сотни и тысячи Т-клеток, уже встречавших вирус, облепят шарики и могут быть «вытащены» из крови за флуоресцентную или магнитную метку.
Т-клеточный репертуар
Уже упомянутый российский профессор Дмитрий Чудаков является автором определения профиля Т-клеточного иммунитета. Он — единственный в мире, кто эффективно определяет специфичность Т-клеток по последовательностям их ДНК и РНК. Это уже не столько метод определения наличия или отсутствия Т-клеточного иммунитета к какому-то конкретному вирусу, а качественная реконструкция всего репертуара Т-клеток в организме.
– Слышала, что недавно вы запустили работу по длительному отслеживанию Т-клеточного иммунитета у двух москвичей, переболевших коронавирусом в 2020 году. Вы намерены контролировать его живучесть в течение всех последующих лет?
– Конечно. В этом и суть длительного контроля. Зато потом мы будем знать, сколько Т-клеток к нынешнему заболеванию останется у них через год, через 5 лет и т. д.
– Сколько сейчас прошло времени после их выздоровления? Сохранились ли у них антитела к коронавирусу?
– Оба переболели в легкой форме в начале марта 2020 года. Через полгода после полного выздоровления количество анти-ковидных антител упало в 2 раза, и оно продолжает медленно снижаться. Но специфичные к коронавирусу Т-клетки памяти (такие хорошо обученные стражи для вторичной инфекции) заняли своё прочное место в репертуаре. Сейчас, спустя почти год после первой встречи с вирусом, каждая тысячная из многих миллионов Т-клеток у обоих этих москвичей стоит на страже их здоровья.
Ученые уверены: если комбинировать два технологически разных подхода по изучению Т-клеток, можно каждому человеку дать очень хорошую характеристику по его устойчивости к новому коронавирусу SARS-CoV-2.
Сейчас среди специалистов идет дискуссия по поводу того, сколько будет работать вакцинация: год-два. Но на уровне Т-клеток она может стать пожизненной. Если это будет доказано, то необходимость в повторной вакцинации отпадет полностью, если, конечно, вирус не будет слишком быстро мутировать.
Диагностика Т-клеточного иммунитета: пандемия как драйвер инновации
Диагностика Т-клеточного иммунитета: пандемия как драйвер инновации
Т-клеточный стартап TScan Therapeutics начал коллаборацию с компанией Qiagen для разработки теста на Т-клеточный иммунитет к COVID-19
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Споры о вакцинах и иммунитете против нового коронавируса кажутся бесконечными! От обсуждения ПЦР-диагностики и тестов на антитела дискуссии постепенно смещаются в сторону стойкости иммунитета: но измерить иммунитет человека по-прежнему сложно. Узнаем о том, как пандемия вдохнула новую жизнь в старую технологию и станет ли диагностика клеточного иммунитета доступной, в статье специалиста по Т-клеткам Софьи Касацкой.
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа заняла второе место в номинации «Академия & бизнес» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Вакцинация от коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 — одна из самых горячих тем на границе 2020 и 2021 гг. Не утихают споры о безопасности вакцин, разработанных в сжатые сроки, о принципах производства и об основных принципах иммуногенности. Много спорят и о том, стоит ли добровольно прививаться тем, кто уже успел переболеть COVID-19, или, по крайней мере, подозревает об этом. Достаточно ли привиться один раз, а если вирус будет мутировать, как действовать дальше? Достаточно ли переболеть один раз или стоит бояться заболеть одной и той же инфекцией раз в сезон?
Для того чтобы ответить на эти вопросы и понять историю прошлых болезней, нужно изучить иммунную память (также ее называют иммунологической). Как правило, для проверки иммунной памяти на конкретную инфекцию проверяют наличие антител в плазме крови: ИФА-тест на антитела класса IgG (ИФА — иммуноферментный анализ). В этом тесте подсчитывается количество антител, которые сорбируются (прилипают) к стандартизированным антигенам, то есть молекулам, встречающимся именно у возбудителя данной инфекции и нигде больше. Антитела, в особенности класса IgG, поразительно точно и выборочно контактируют с однажды «выбранной» молекулой: мало где в биологии можно найти более точные и постоянные молекулярные контакты. Тем не менее тест на антитела — по большей части дань историческому процессу, а не «золотой стандарт» тестирования иммунной памяти. Пандемия стремительно изменила многие аспекты нашей жизни — может ли она поменять и то, что мы считаем стандартом в диагностике иммунитета?
Увидеть адаптивный иммунитет
«Биомолекула» неоднократно писала об уникальных механизмах, которые обеспечивают работу этой удивительной регуляторной системы — системы адаптивного иммунитета человека [1–3].
Чтобы увидеть Т-клетки и В-клетки разных типов, иммунологи чаще всего используют проточную цитометрию (FACS) [4]. Например, если мы хотим увидеть клетки памяти, то крепим флуоресцентную метку на молекулу, присутствующую только на поверхности клеток иммунной памяти, и подсчитываем клетки, пролетающие по одной через лазер и детектор флуоресценции.
Так можно узнать процент клеток, выполняющих определенную функцию, например, весь объем клеток памяти в крови на все прошлые инфекции. Теперь усложним задачу и выделим только клетки памяти на конкретную инфекцию — например, интересующий всех SARS-CoV-2, — как это сделать? Мы можем увидеть недавно активированные клетки среди клеток памяти. Лимфоциты из образца крови пациента смешиваются и инкубируются с молекулами, принадлежащими вирусу, чаще всего, — с очищенными белками, нарезанными на фрагменты. Т- и В-клетки, способные узнать и связать вирусный антиген, активируются, станут активированными эффекторными клетками, и мы сможем их различить среди всей иммунной памяти на FACS-анализе. Такие тесты проводятся в качестве дополнительных научных исследований.
Тест требует не только несколько часов на выделение клеток и их активацию вирусными белками либо пептидами, но и время дорогостоящего специалиста по проточной цитометрии, у которого прибор для FACS всегда работает и настроен, а не простаивает. Сочетание сразу двух факторов приводит к тому, что метод далеко не массовый. Можно представить метод рутинным в нескольких ведущих медицинских центрах, но сложно распространить: на порядки сложнее, чем внедрить регулярное ПЦР-тестирование.
Антитела или Т-лимфоциты
В качестве гораздо более дешевого и доступного теста, чем FACS, иммунологи смотрят не на сами клетки, а на то, что иммунные клетки производят [5]. Вспомним рецепторы, которые служат для решения задачи точного, прочного и выборочного связывания вирусных белков-антигенов. Т-клетки держат рецепторы на поверхности, на клеточной мембране. А вот В-лимфоциты свои уникальные рецепторы синтезируют как в мембранной, так и в растворимой форме — эти растворимые В-клеточные рецепторы и есть антитела. Получается, что вместо флуоресцентных меток и В-клеток памяти можно просто измерить концентрацию антител? Вдобавок, учебник иммунологии рассказывает, что В-клетки формируют память с помощью Т-клеток. Значит ли это, что если антитела есть, то уже произошло формирование памяти: сначала на уровне Т-клеток, затем на уровне В-клеток?
Да, текущие представления об иммунологии человека говорят: высокий уровень антител подразумевает, что Т-клеточный иммунный ответ тоже есть. Тем не менее известны и неклассические механизмы, при которых В-клетки быстро начинают производить антитела (чаще классов IgD, IgM) вне особых зон лимфоузла и при меньшем контроле со стороны Т-клеток. Обратная логика оказывается неверной: Т-клеточная иммунная память не зависит от наличия антител в крови, формируется независимо и сохраняется дольше.
Интуитивно кажется, что было бы отлично сохранять в крови антитела к коронавирусу после вакцинации или инфекции на всю жизнь. Некоторые инфекции формируют такой иммунный ответ, и это коррелирует с иммунной защитой, то есть вероятностью не заболеть при повторном заражении [6]. Но для других инфекций уровень антител в крови достаточно быстро, за несколько месяцев, снижается. Так происходит потому, что за свою жизнь человек встречает сотни тысяч типов вирусов, и производить антитела на все вирусные антигены просто невозможно. Приходится выбирать, происходит конкуренция с защитой от других инфекций, а также конкуренция с антителами, которые нужны для регуляции собственной физиологии организма. Антитела постепенно снижают концентрацию и пропадают из крови, но сохраняются В-клетки памяти, которые смогут вновь производить нужные антитела при необходимости.
Было бы идеально, чтобы организм производил антитела и держал их в оптимальной концентрации в крови не во время повторной болезни, а чуть заранее: до заражения. Именно для этого существуют сезонные ревакцинации: небольшая бустерная доза антигена поступает заранее и через 9–14 дней иммунитет снова подготовлен к сезонному контакту с большим количеством вирусных частиц вокруг. А постоянное, круглогодичное производство антител на высоком уровне можно оставить тем В-лимфоцитам, которые действительно каждый день сталкиваются с одними и теми же бактериями и вирусами: например, В-лимфоцитам слизистой ЖКТ, работающим с кишечными симбионтами.
ELISPOT: ИФА для Т-клеток?
Антитела оказались удобным для измерения косвенным маркером иммунной памяти, но отсутствие антител еще не говорит об отсутствии Т-клеточной памяти. Специфичную иммунную память Т-клеток, к сожалению, нельзя измерить так же легко, по нескольким миллилитрам плазмы крови. Как упоминалось выше, Т-клетки не секретируют свои рецепторы в растворимом виде. Зато Т-лимфоциты, в соответствии со своей ролью дирижеров всего иммунного ответа, вырабатывают множество сигнальных молекул — цитокинов. Цитокины, в большинстве своем, — тоже растворимые молекулы, и их концентрацию можно измерить в объеме (суммарно), либо «подсветить» с помощью флуоресцентных меток сразу при их секреции из специфичных Т-клеток (и увидеть соответствие клетка—сигнал). На этом принципе основан иммуноферментный анализ на клональных отпечатках Т-клеток, или ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot).
Как правило, Т-хелперы секретируют сигнальные цитокины, чья основная задача — активировать нужную ветвь иммунного ответа, привлечь клетки врожденного иммунитета и подавить конкурирующие сигналы. Среди функций цитокинов — подача сигналов внутри иммунной системы — от Т-клеток и для Т-клеток для уточнения принятия решений. Подобная информация «для внутреннего использования» передается и от Т-хелперов Т-киллерам, и в обратном направлении. Яркий пример такого сигнала — интерферон-гамма: активированные Т-киллеры секретируют IFNγ наравне с Т-хелперами. Массовая выработка интерферона позволяет быстро распространить информацию на уровне всего организма. На основе измерения продукции IFNγ Т-клетками разработан самый надежный из ELISPOT-тестов на антиген-специфичный Т-клеточный ответ [7], [8].
Для ELISPOT живые изолированные Т-клетки периферической крови инкубируются с антигенами, как правило, белковыми либо пептидными. Этот процесс должен имитировать то, как в организме Т-клетки в лимфоузлах узнают антигены и активируются: процесс презентации антигена. Небольшая доля специфичных клеток узнает антигены и производит IFNγ, причем интерферон сразу фиксируется и позже визуализируется в точке секреции. В процессе активации Т-клетки делятся: из одной клетки образуется целый клон антигенспецифичных клеток, все они производят интерферон, и при визуализации «пятно» продукции интерферона растет в диаметре (рис. 1). При ELISPOT сложно точно сказать, сколько антигенспецифичных клонов было изначально в образце до активации, размножения и формирования пятна. Остается неясным, сколько Т-клеток узнают антиген in vivo, но не прореагировали из-за искусственной формы презентации антигена, не похожей на то, как Т-клетки обычно активируются в лимфоузлах. С другой стороны, метод немного проще оптимизировать в лаборатории и проще делать для многих пациентов одновременно, чем более дорогостоящий FACS-анализ; требующиеся приборы и реагенты дешевле.
Рисунок 1. Схема работы теста ELISPOT, определяющего активацию Т-лимфоцитов при взаимодействии с антигенами нового коронавируса SARS-CoV-2
[11], рисунок с изменениями
Поиск коронавирусных Т-клеток. Инновация TScan
ELISPOT используется во всех лабораториях, которые исследуют иммунитет человека. Метод ELISPOT и его модификации на пересекающихся пулах пептидов (наборах фрагментов, на которые нарезается белковый антиген) использовались в исследованиях эффективности вакцин от ВИЧ, и позже медленно распространились на исследования и других вакцин. В диагностических лабораториях метод стал популярен потому, что для более точной диагностики туберкулеза необходимо оценивать Т-клеточный иммунный ответ. Коммерческий тест получил название T-SPOT. Кроме туберкулеза, для других инфекций аналогичная диагностика не применялась — до 2020 года и кризиса, вызванного новой коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2. Необходимость широкой диагностики самой инфекции и иммунной памяти к ней подтолкнула одновременно исследователей и производителей диагностических тестов к разработке новых методов и оптимизации старых и привычных. Интерес к быстрому и дешевому измерению Т-клеточной памяти растет параллельно с популярными в медиа опасениями, что у переболевших COVID-19 быстро пропадают антитела в крови.
Очень многие академические коллективы, которые работают на стыке биохимии, иммунологии человека и прикладных биотехнологий, весной 2020 года стали заниматься разработками для борьбы с пандемией, в том числе разрабатывать и налаживать диагностику инфекции. Нельзя не упомянуть пример коллектива Григория Ефимова из НМИЦ гематологии в Москве, активно работающий как над диагностикой Т-клеточного иммунитета к новому коронавирусу на основе FACS, так и в коллаборации по созданию одного из ИФА-тестов для определения антител к антигенам SARS-CoV-2 [9], [10]. Тем не менее вернемся к теме масштабируемого производства быстрых ELISPOT-тестов на Т-клеточный иммунитет: откуда берутся такие разработки, тоже из фундаментальных и клинических академических лабораторий?
Первой ELISPOT-тест на ковид (T-SPOT Discovery SARS-CoV-2 assay) выпустила компания Oxford Immunotec, ранее создавшая одну из самых популярных версий теста на туберкулез [11]. Этот тест использует пул разнообразных антигенов коронавируса и активацию Т-клеток в смеси с другими лейкоцитами периферической крови: иначе говоря, дизайн теста даже несколько упрощен по сравнению с тестом на туберкулез (рис. 1).
Куда более интересную модификацию запустил небольшой биотех-стартап под названием TScan Therapeutics. Этот стартап переориентировался на инфекционную иммунологию во время пандемии. Как и многие другие коллективы, к примеру, BioNTech (разработчик вакцины от коронавируса совместно с Pfizer), до пандемии они занимались онкологией и задачей оптимальной активации противоопухолевого иммунитета.
Осенью 2020 года TScan Therapeutics подписали соглашение о совместной разработке диагностического теста ELISPOT-типа с компанией Qiagen — крупнейшим производителем лабораторных реагентов и универсальных наборов для типовых экспериментов в молекулярной и клеточной биологии [12], [13]. Эта диагностика Т-клеточной памяти во многом отличается от версии Oxford Immunotec, и в первую очередь отличается идеологически: оксфордская компания быстро и практично сделала аналог своего существующего продукта-бестселлера, сохранив всю платформу и протокол метода и изменив только антиген. TScan же демонстрирует почти идеальный инновационный подход: вначале провели исследования Т-клеточного иммунитета, опубликовали выводы в престижном журнале Immunity, затем появилась идея для диагностического теста и, наконец, возможность производства в партнерстве с Qiagen.
Исследование TScan раскрывает детали того, какие молекулы среди белков коронавируса вызывают наибольший «интерес» у Т-клеток человека [14]. Иммунная память Т-киллеров, согласно исследованию, формируется не только и не столько на фрагменты антигена (эпитопы) S-белка коронавируса, на котором сфокусировано большинство вакцин 2020 года [15]. Напротив, эпитопов гораздо больше в нуклеокапсидном основном белке [16]. Далее, специалисты TScan показали отсутствие перекрестного иммунитета: антигены «сезонных» неопасных человеческих коронавирусов формируют память Т-киллеров, но эти Т-киллеры не способны отреагировать на коронавирус SARS-CoV-2. Наоборот, между SARS-CoV-1 (вызвавшим вспышку атипичной пневмонии в 2003 году) и SARS-CoV-2 существует значительная кросс-реактивность Т-клеток (переболевшие атипичной пневмонией могут быть защищены от SARS-CoV-2).
Обнаружение важнейших участков вируса, вызывающих долгую Т-клеточную память — это поиск иммунодоминантных эпитопов. Если активировать Т-клетки именно такими пептидами, можно существенно повысить качество диагностического теста. Уникальные данные TScan позволяют вычесть фон иммунной памяти на родственные и далекие коронавирусы и поднять специфичность диагностики иммунной памяти. При этом используется платформа, сходная с ELISPOT, что позволяет объединять много образцов и делать тест быстрым и широко доступным. Сейчас исследования Т-клеточного иммунитета при коронавирусе проводится либо в рамках научных исследований, либо на коммерческой основе, но точность и интерпретация теста затруднена, клиент получает результат через 1–2 неделю после теста. Партнерство TScan с Qiagen вселяет оптимизм по поводу доступности теста: ведь продукцией этой компанией пользуются буквально в каждой молекулярной и биохимической лаборатории на планете.
Интересна еще одна деталь. Исследователи из TScan брали донорские Т-клетки у доноров с наиболее распространенными в США генотипами других важных иммунных молекул: молекул HLA (молекул главного комплекса гистосовместимости, Human Leukocyte Antigen) подтипов HLA-A*02:01, HLA-A*01:01, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*24:02 и HLA-B*07:02. В зависимости от типа молекул HLA Т-клетки будут распознавать разные эпитопы одного и того же вируса. А поскольку у разных людей максимально вариабельные молекулы HLA, то и иммунный ответ Т-клеток у каждого формируется максимально индивидуально. Именно с этим связаны и сложности/дороговизна изучения Т-клеточного иммунитета, и невозможность «перелить иммунную память» переливанием крови — такой эксперимент может получиться только внутри пары однояйцевых близнецов. С другой стороны, даже в этом огромном разнообразии реакций клеточного иммунитета Т-клетки разных доноров, отвечающие на новый коронавирус, обладают некоторыми общими характеристиками.
Данные об общих параметрах иммунного ответа, которые будут накапливаться в совместных исследованиях TScan/Qiagen, представляют несомненный интерес для оптимизации лечения пациентов и создания методов лечения, таргетно направленного на активный и безопасный Т-клеточный ответ. Здесь проявляется особая черта сильных deeptech-стартапов в области биологии, биоинформатики и биотехнологий: технологическая платформа может быть использована не только для одного применения и быстрого завоевания рынка, а для разных задач, и в процессе, по ходу решения прикладной задачи возникают ценные, качественные и заметные научные открытия. Конечно, новость о сотрудничестве TScan и Qiagen — всего лишь одна из множества историй о биотех-прорывах 2020 года, и легко могла затеряться среди других новостей и инноваций. Но в этой неприметной новости заложен мощный потенциал, способный изменить современные представления о клинической диагностике иммунной памяти.